Родословное древо дрожжей: исследователи нарисовали геномное древо Saccharomyces cerevisiae

Пер Кёльстер (Per Kølster), который выращивает свое собственное сырье для варки пива в сельской местности за пределами Копенгагена, Дания, насколько лет назад направился на восток, чтобы узнать больше о традиционном фермерском пивоварении. В Литве он сварил пиво с местным фермером, и когда пришло время засыпать дрожжи, они пошли на соседнюю ферму взять то, что им было нужно. По пути туда фермер сказал Кёльстеру, что не надо благодарить за дрожжи. Он объяснил, что поскольку дрожжами не владеет никто, они должны быть доступны для всех, и слова благодарности расстроили бы эту систему.

Коммерческие пивоварни все еще делятся дрожжами, но не так много и не так уж часто. До 1980 года охранник на воротах пивоварни Carlsberg выдавал небольшие количества из «дрожжевой башни» местным жителям, которые об этом просили. Кёльстер приводит эту башню, как пример, что может значить слово «культура». Это нечто совершенно противоположное «пастеризованному подходу к культуре», писал он в email. «Разнообразие и жизнестойкость против подконтрольной чистоты и управляемой интенсивности».

Думается, в наши дни существует больше, чем одна концепция брожения. Некоторые пивовары ориентированы на разноплановые вкусы и ароматы, часто описываемые, как кислые (sour) или дурнопахнущие (funky), как результат спонтанного брожения, смешанного брожения или ферментации с дрожжами, выделенными из дикой природы.  Другие, чтобы внести разнообразие, ожидают от коммерческих лабораторий новых чистых штаммов. И есть те, кто довольны доступными вкусоароматическими профилями, но ищут разновидности, которые можно в общих чертах классифицировать, как более результативные.

Все эти группы – генетическое родовое древо Saccharomyces cerevisiae (один из 1500 известных видов дрожжей), нарисованное исследовательскими группами White Labs в Калифорнии и бельгийской генетической лабораторией. Воссоздание того, что происходило в отдаленном прошлом, геномного древа – которое включает две отдельные генеалогические линии пива – предоставляет пивоварам орудия для создания нового будущего.

«Как мне кажется, это только начало», говорит основатель White Labs Крис Уайт (Chris White). «Понимание ДНК будет первой частью этой истории. Мы будем просеивать очень много информации. Из этого выйдет намного больше».

ОБШИРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первые результаты были опубликованы в научном журнале Cell в сентябре прошлого года. Заголовок в The Economist сформулировал их с типично британской сдержанностью: «Прирученное спиртное». The Washington Post была более пространной: «Пивные дрожжи – послушные. Винные дрожжи – дикие. Выводы делайте сами». Заголовки предлагают сокращение разнообразия, но не факт, что это один из выводов исследования. Напротив, авторы пишут, что одним из выводов из различий между пивоварением и виноделием стало «большое генетическое разнообразие в среде пивных дрожжей, в то время как винные генетически более однородны».

Исследователи из Австралии пришли к похожему заключению после расшифровки последовательности геномов сотен штаммов винных дрожжей. Они обнаружили, что штаммы дрожжей, продаваемые разными компаниями, были почти идентичными с генетической точки зрения. «Наши результаты показывают, что только лишь небольшая ветвь эволюционного древа дрожжей в данное время используется в виноделии», говорит Энтони Борнмэн (Anthony Borneman) из Австралийского института исследования вина.

Впервые ученые расшифровали генетическую последовательность штаммов дрожжей, используемых пивоварами и хлебопеками, в 1996 году, определив порядок всех 12 057 500 субъединиц, содержащихся в ядерной ДНК дрожжей.   Это был шаг в направлении определения последовательности человеческого генома, проект, который занял почти 10 лет и стоил около 3 миллиардов долларов к моменту завершения в 2000 году. С тех пор прогресс в области технологий ускорил и удешевил процесс, сделав его достаточно доступным, чтобы в 2012 году Illumina, биотехнологическая компания из Сан-Диего, расположенная недалеко от White Labs, расшифровала последовательность 96 штаммов бесплатно, чтобы протестировать новую аппаратуру.

«Расшифровка генома ранее всегда была самым сложным этапом. Больше это не так», говорит Уайт. «Сейчас пришло время скомпоновать всю информацию, чтобы свести ДНК и фенотип».

Штаммы, которые генетически близкородственны, могут вести себя совершенно по-разному в пиве. «Все отличалось больше, чем я ожидал», говорит Troels Prahl, глава по разработкам и научный руководитель White Labs. Часть меня надеялась, что мы найдем лишь несколько (уникальных разновидностей), но мы не нашли много «двойников». Истинное разнообразие. Мы не делаем по 100 штаммов каждую неделю просто потому, что нам так хочется».

Совместные исследования начались вскоре после того, как White Labs начали работать над данным проектом в 2012 году. Prahl делал доклад на конференции, где узнал, что бельгийская группа также изучала фенотипический «ландшафт» дрожжей. Вместе две команды расшифровали последовательность геномов 157 промышленных изолятов S.cerevisiae. Эта коллекция включает в себя 102 коммерческих штамма пивных дрожжей, 19 винных штаммов, 11 штаммов спиртовых, семь штаммов дрожжей для сакэ, семь штаммов, выделенных при спонтанном брожении, пять штаммов биоэтанола, четыре – хлебных и два лабораторных штамма.  (Когда при характеристике пива используется слова «промышленное», это часто придает негативное звучание, но Уайт объясняет, что ученые используют его для описания дрожжей, отобранных для распространения с коммерческими целями.)

Результаты наглядно показывают, что современные дрожжи S.cerevisiae (поскольку именно они были в центре исследования, где они просто обозначались как «дрожжи») отчетливо отличаются от диких дрожжей в силу отбора человеком и, иногда, из-за географии. Культурные пивные дрожжи отличаются от диких штаммов, так же как те, что использовались для приготовления вина или хлеба, во многих весомых отношениях:

• Они более эффективно преобразовывают мальтозу (солодовый сахар, который производят пивовары) в алкоголь.
• Они флоккулируют, или оседают, лучше, из-за чего пиво осветляется лучше естественным образом.
• Они больше не скрещиваются, поэтому меньше вероятность изменений, когда пивовары используют из повторно.
• Большинство не производят фенолов, запах которых можно описать, как нечто среднее между пряным и запахом изоленты.

ДВЕ ГЕНЕАЛОГИЧЕСКИЕ ЛИНИИ

Хотя лишь в 19 веке ученые повсеместно признали, что дрожжи – это микроорганизмы, и они ответственны за брожение, пекари, пивовары и виноделы производили хлеб, пиво и вино тысячи лет. Они изучили, как повторно использовать дрожжи, тот «backslopping», вкусный термин, который описывает процесс, когда они засеивали не ферментированную еду или напитки порцией ферментированного продукта, что приводило к прогнозируемому брожению. Доклад в Cell высказывает мнение, что именно постоянный рост в искусственно созданной человеком среде привел к окультуриванию, и к тому, что существуют две отдельные генеалогические линии пивных дрожжей. Первая датируется годами между 1573 и 1604. Это исторически совпадает с переходом от пивоварения преимущественно в домашних условиях к коммерческому пивоварению в большем, фактически, промышленном, масштабе. Скорее всего, вторая генеалогическая линия берет свое начало между 1645 и 1671.

Первая, обозначенная, как Beer 1, включает три отдельные, территориально несовпадающие, группы. Она берет свое начало в регионе, где сейчас находятся Германия и Бельгия, распространяется сперва на Великобританию, и затем на США. Данные показывают, что пивные дрожжи США были скорее импортированы из Европы во время колонизации, нежели произошли от коренных диких дрожжей. Они наиболее близкородственны британским пивным дрожжам, и это позволяет предположить, что происхождение пивоваренных штаммов США может прослеживаться до времен введения британскими переселенцами пивной культуры в стране в начале 17 века.

«Мы намеренно завуалировали, с какой конкретно пивоварни были взяты какие дрожжи, чтобы защитить права пивоваров», говорит Кевин Верштрепен (Kevin Verstrepen), генетик в области дрожжей из Университета Лёвена (University of Leuven) и Фландрского института биотехнологий [Бельгия] (Flanders Institute for Biotechnology), так как многие пивоварни «считают свои дрожжи чем-то вроде сверхсекретного ингредиента». Следовательно, на [генеалогическом] древе нет отдельного ответвления под названием «Duvel» или «Sierra Nevada».  И даже хотя исследователи поместили элевые дрожжи White Labs California Ale Yeast (001) в группу Beer 1, это не означает, что другие характернейшие американские элевые дрожжи Wyeast American Ale (1056), также относятся к ней.

Однако, когда Illumina впервые расшифровывала последовательность генома дрожжей из лаборатории White labs, Уайт заказал сравнение нескольких штаммов из других лабораторий наряду со своими собственными. «Элевые дрожжи California очень для нас важны, мы сделали это просто забавы ради», сказал он, обсуждая 001 и 1056. «Оказывается, они отличаются. О чем я и говорил все это время». Когда Illumina сравнила другие штаммы, о которых говорилось, что они происходят из того же промышленного источника, что и дрожжи Уайта, они действительно оказались такими же.

Дрожжи Beer 2 более устойчивы к стрессу и потому более успешно ферментируют виды пива с высоким уровнем алкоголя. Они – более близкие родственники винным дрожжам, чем Beer 1; Beer 2 помещены рядом с винными в круговом полярном формате, который исследователи выбрали для своего филогенетического древа. Beer 2 включает одну пятую пивоваренных штаммов, но в отличие от Beer 1 они не подпадают под географическую схему и содержат дрожжи происходящие из Бельгии, США, Великобритании, Германии и Восточной Европы. Исследование дает понять, что два независимых европейских «внутренних факторов», одним из которых является зарождение как винных дрожжей, так и дрожжей типа Beer 2, привели к распределению пивных на 2 группы.

Некоторое количество таинственности остается, в частности, когда дело доходит до одной общей черты. В состав обеих групп входят дрожжи, позитивные на содержание побочных фенолов (POF+) и дрожжи с негативным результатом на фенолы (POF-). Дрожжи POF+ взаимодействуют с феруловой кислотой осоложенного зерна для производства 4-винилгваякола, что придает пиву характерный вкус и аромат, напоминающий гвоздику, что считается положительной чертой в немецкой разновидности пшеничного пива (hefeweizen) и некоторых видах пива бельгийского происхождение, но в для всех остальных это, как правило, посторонний привкус.

Дикие дрожжи – POF+, но в докладе указывается, что средневековые пивовары, должно быть, на раннем этапе имели отобранные POF-, объясняет Верштрепен, так как именно такой вид наиболее вероятно послужил отправной точкой для окультуривания. «Мы не можем пока ответить на самые интригующие вопросы – как именно они это сделали», говорит он. Каждая ферментация будет содержать несколько микроорганизмов, которые становятся POF- из-за спонтанной мутации, но их будет «лишь одна или несколько на бессчетное количество POF+». Тем не менее, это произошло как для семейства  Beer 1, так и для Beer 2.

«Похоже на то, что дрожжи POF+, которые использовались для некоторых видов пива, скорее восстановили свои POF-характеристики, нежели сохраняли их на протяжении времени, вероятнее всего благодаря скрещиванию с дрожжами POF+, или, по меньшей мере, они получили некую часть ДНК таких дрожжей», говорит он.

НОВЫЙ СПОСОБ

Ученые теперь знают, что и какие «монтажные» инструменты требуются для видоизменения ДНК, поэтому будет достаточно легко «перебросить» связанные с POF гены, или исключить их. Два года назад микробиолог той же лаборатории, что и Верштрепен, рассказывал The New York Times: «Прямо сейчас у нас несколько сотен генетически модифицированных штаммов дрожжей, они терпеливо ожидают в холодильнике нашей лаборатории». Однако, пивоварское сообщество единодушно и непоколебимо против генетического модифицирования (ГМ). Например, White Labs запретила использовать генетически модифицированные дрожжи в своих помещениях, опасаясь, что кто-нибудь может случайно смешать их с местными штаммами. Лаборатория, где работает Верштрепен, использовала иной подход к созданию новых штаммов. Невзирая на то, что их исследования определили, что 40 процентов штаммов коммерческих дрожжей неспособны воспроизводить себя половым способом, а остальные показывают резко сниженную половую фертильность, для воспроизведения таких штаммов в лаборатории работают автоматизированные системы. «Мы хорошо оптимизировали условия, поэтому те штаммы, у которых очень слабые половые циклы, все еще можно «убедить» размножаться; все это вопрос оптимизации окружающей среды», говорит Верштрепен. «Хочу подчеркнуть, что это очень природный процесс, совершенно то же самое, чем занимались и все еще занимаются фермеры. Но роботы позволяют нам продвигаться вперед намного быстрее, таким образом, мы можем, надо надеяться, догнать и даже превзойти успехи в выращивании сельскохозяйственных культур и животноводстве».

Лаборатория уже продала новые штаммы нескольким пивоваренным производствам, некоторые из них крошечные, некоторые мультинациональные. «Какие потребители хотят перемен. Это пример такой ситуации. Мы собираемся получить дрожжи, которые создадут стили, о каких мы даже еще и не думали», говорит Уайт. Однако, производство новых штаммов не было единичной целью проекта, начатого White Labs. «Для меня целью всегда была наука и информация. Мы хотели лучше представлять себе эти штаммы», говорит он.

Выступая в Балтиморе в июне прошлого года на Homebrew Con, ежегодном собрании американских домашних пивоваров, Уайт рассказывал, как быстро менялось представление. Десять штаммов пивных S. cerevisiae из совместного проекта используются в коммерческом производстве лагеров чаще, чем «традиционные» лагерные штаммы, или Saccharomyces pastorianus, которые сами по себе являются гибридом S. cerevisiae и S. eubayanus. Очевидно, что в этой сфере необходимо намного больше исследований. Лагеры долго составляли большинство среди производимых видов пива, но происхождение их дрожжевых штаммов были полны тайн. S. eubayanus были обнаружены лишь в 2011, сначала в дикой природе Патагонии, но с тех пор и в других зонах.  Юрген Вендланд (Jürgen Wendland), в прошлом биолог по дрожжам пивоваренного производства Carlsberg, недавно написал, что «расшифровка генома лагерных дрожжей находится только на начальном этапе».

В Балтиморе Уайт преподнес это более радикально.  «Без ключа к генетической информации наше мышление все еще на уровне 60-х годов 19 века», сказал он. Он продемонстрировал слайд с S. cerevisiae, элевыми дрожжами верхового брожения, на одной половине и S. pastorianus, лагерными дрожжами низового брожения, на другой.  «Я рад, что вы приходите к этому разговору, потому что мы, как бы, на грани», сказал он. «Вот это – старый способ обсуждать такие вещи. В течение нескольких следующих лет появится новый».

ВОИСТИНУ ДИКИЕ

Когда пивовары упоминают «дикие дрожжи», они включают туда Brettanomyces, хотя наиболее часто они покупают их в лаборатории, а также Lactobacillus и Pediococcus, которые являются не дрожжами, а бактериями.  Джаспер Акербум (Jasper Akerboom), который курирует контроль качества в Lost Rhino Brewing, штат Вирджиния, а также заведовал лабораторией Bright Yeast Labs, выражается более определенно.

Он выделил более 100 одиночных штаммов Saccharomyces cerevisiae, собранных в природной среде, которые впоследствии будут использоваться для ферментирования пива. Всех их объединяет, как он это называет, «прямолинейный» характер. «Я не нашел ничего истинно умеренного», говорит он. Напротив, они склонны быть «неконтролируемыми», сложноэфирными, и для брожения часто требуется более высокая температура. Большинство из них не очень хорошо флоккулируют. Все они POF+, поэтому лучше подходят для варки сэзонов, чем пейл элей.

Они очень похожи на те, которые пивовары отобрали 500 лет назад – за исключением того, что те дрожжи жили в «смешанной культуре», которая включала больше, чем один штамм S.cerevisiae, равно как и Brettanomyces, и бактерии. Такой новый интерес к диким дрожжам дает ученым возможность проследить, как развивается штамм, когда начинает окультуриваться.

В Копенгагене, где работает Troels Prahl, White Labs выпустила штамм, выделенный из яблок, спонтанно ферментированных на уединенном острове у берегов Дании.  «Поставлена цель добиться (чистых) автохтонных дрожжей, которые подходят для пивоварения и безопасны для потребления во все времена года в определенном ареале или регионе», говорит Prahl. Дрожжи бродят при прохладной, подходящей для лагера температуре, создавая пиво «приятное и сухое, но с ароматикой такого лагера, которого вы никогда не пробовали».